先前小達(dá)君給大家介紹了Strep-tag? 的歷史（點(diǎn)此回顧您想了解的Strep-tag：Strep-Tactin?XT發(fā)展史都在這里！），現(xiàn)在再隆重介紹 Strep-tag? 在哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用。另外，小達(dá)君保證您看完后會(huì)心動(dòng)，然后回來(lái)參加活動(dòng)（點(diǎn)此參加分享IBA蛋白純化體驗(yàn)，獲贈(zèng)蛋白純化填料哦！），獲贈(zèng)蛋白純化填料哦！

雖然大腸桿菌E.coli表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，但由于缺乏重要的脂類(lèi)，分子螫合物，以及重要的翻譯后修飾，用它表達(dá)真核蛋白，可能會(huì)影響蛋白本身的折疊及功能，以膜蛋白為例，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)能影響目標(biāo)蛋白在細(xì)胞膜的插入位置及其應(yīng)有的功能^[1]。除此之外，當(dāng)目標(biāo)蛋白大于50kDa時(shí)，使用大腸桿菌系統(tǒng)可能表達(dá)出不完整的蛋白^[2]。

所以，為了研究特定蛋白的功能（如：信號(hào)通路），生產(chǎn)較大型的蛋白，或進(jìn)行高解析度的結(jié)構(gòu)分析，愈來(lái)愈多的實(shí)驗(yàn)室選擇哺乳類(lèi)表達(dá)系統(tǒng)來(lái)生產(chǎn)融合蛋白。其原因?yàn)椴溉閯?dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)出的重組蛋白與人類(lèi)蛋白十分相似，有較完整的蛋白折疊、組合及翻譯后修飾^[3]。因此，愈來(lái)愈多科學(xué)家們更加關(guān)注于—如何從哺乳類(lèi)細(xì)胞中高效的純化目標(biāo)蛋白。

首先，需考慮選擇合適的親和標(biāo)簽。常用于哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的親和標(biāo)簽有His-tag、FLAG-tag、GST-tag及Strep-tag?等^[4-12]，整理于下表：

使用His-tag時(shí)，常遇到的問(wèn)題是寄主蛋白與填料的非特異性結(jié)合，在哺乳動(dòng)物重組蛋白的純化過(guò)程中，這樣的情況更為明顯。由于系統(tǒng)中有很多含有組氨酸（histidine）的殘基的蛋白，這種蛋白結(jié)構(gòu)與his-tag相似，容易與鎳柱結(jié)合，因此導(dǎo)致目標(biāo)蛋白純度降低^[13]。

FLAG-tag系統(tǒng)可在非變性條件下進(jìn)行純化，能得到高純度、有活性的蛋白，但其缺點(diǎn)為純化介質(zhì)較為不穩(wěn)定，且純化成本高上許多^[5]。

另一常用的標(biāo)簽為GST-tag，一個(gè)26kDa的蛋白，其特點(diǎn)是表達(dá)量高，具高度抗原性，常用來(lái)增加目標(biāo)蛋白的溶解度，但常常會(huì)影響目標(biāo)蛋白的特性，一般推薦純化后將標(biāo)簽去除^[8]。

而Strep-tag?（包含Strep-tag?II或是Twin-Strep-tag?），都是短肽標(biāo)簽，分別為8或28個(gè)氨基酸，一般不干擾蛋白折疊或活性，因此適合用于蛋白功能性研究^[5]。Strep-tag?可以特異性地結(jié)合在Strep-Tactin?(二代介質(zhì))或Strep-Tactin?XT(三代介質(zhì))的生物素的結(jié)合位點(diǎn)。洗脫時(shí)使用的脫硫生物素（適用于二代）或生物素（三代），對(duì)同樣的結(jié)合位點(diǎn)有更高的親和力，能將目標(biāo)蛋白從同樣位置移除，因此得到的目標(biāo)蛋白純度一般高于95%^[12]。

同時(shí)，三代的 Strep-Tactin?XT與Strep-tag?蛋白的親和力大幅提升，直接加入含目標(biāo)蛋白的哺乳細(xì)胞的培養(yǎng)上清，即可高效純化出所需蛋白（注：原本使用二代需先以Avidin或是BioLock將培養(yǎng)基中的生物素遮蔽，才不會(huì)影響純化表現(xiàn)）。

圖A比較了His-tag與Strep-tag?直接加入哺乳細(xì)胞培養(yǎng)上清純化目標(biāo)蛋白的表現(xiàn)。

此外，我們也測(cè)試了其他的蛋白，例如SEAP（72 kDa）或抗體（mAb，其重鏈為55kDa）。圖B為以Strep-Tactin?XT純化SEAP-TST、mCherry-TST與mAb-TST的SDS-PAGE分析結(jié)果，可見(jiàn)對(duì)于不同蛋白，Strep-tag?系統(tǒng)都能純化出高純度的目標(biāo)蛋白。(注:紅色標(biāo)記處為 mCherry的降解產(chǎn)物，非雜帶)

因Strep-Tactin?XT與Twin-Strep-tag蛋白的高親和力，即使目標(biāo)蛋白的濃度低，使用Strep-Tactin?XT仍可以有效的捕捉上清中的目標(biāo)蛋白。表C整理了幾個(gè)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，顯示當(dāng)目標(biāo)蛋白濃度低于20μg/ml時(shí)，得率仍能達(dá)到幾近100%。

除了上述實(shí)驗(yàn)所用的CHO細(xì)胞株外（中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞），另一常用于生產(chǎn)蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞株為HEK293(人胚胎腎細(xì)胞)，使用上較CHO簡(jiǎn)單。我們測(cè)試了Strep-Tactin?XT的純化表現(xiàn)：表D1為以Expi293表達(dá)SEAP-TST或mAb-TST蛋白后，目標(biāo)蛋白的濃度。圖D2為純化表現(xiàn)的SDS-PAGE分析。從中可知，與ExpiCHO培養(yǎng)基相同，直接將表達(dá)好的Expi293上清加入1ml Strep-Tactin?XT高載量重力柱中進(jìn)行純化，一樣能夠快速的得到高純度的目標(biāo)蛋白。

綜上所述，Strep-tag?非常適合用在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中表達(dá)目標(biāo)蛋白，其純化過(guò)程也與常見(jiàn)的ExpiCHO及Expi293培養(yǎng)基相容，不須另外處理，讓實(shí)驗(yàn)流程更為便利。加上Strep-tag?系統(tǒng)在純度上的優(yōu)勢(shì)，是目前在這個(gè)應(yīng)用上的絕佳選擇。

參考文獻(xiàn)

[1] Sahdev S, Khattar SK, Saini KS (2008). Production of active eukaryotic proteins through bacterial expression systems: a review of the existing biotechnology strategies. Mol Cell Biochem., 307(1-2):249-64

[2] Dyson MR, Shadbolt SP, Vincent KJ, Perera RL, Mccafferty J (2004). Production of soluble mammalian proteins in Escherichia coli: identification of protein features that correlate with successful expression. BMC Biotechnol., 4:32. doi: 10.1186/1472-6750-4-32

[3] Khan KH (2013). Gene Expression in Mammalian Cells and its Applications. Adv Pharm Bull., 3(2): 257-63. doi: 10.5681/apb.2013.042

[4] Wegner GJ, Lee HJ, Corn RM (2002). Characterization and optimization of peptide arrays for the study of epitope-antibody interactions using surface plasmon resonance imaging. Anal Chem., 74(20):5161-8.

[5] Terpe K (2003). Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl.Microbiol.Biotechnol.,60(5): 523-33. doi: 10.1007/s00253-002-1158-6

[6] Lichty JJ, Malecki JL, Agnew HD, Michelson-Horowitz DJ, Tan S (2005). Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr Purif., 41(1):98-105.

[7] Tessema M, Simons PC, Cimino DF, Sanchez L, Waller A, Posner RG, Wandinger-Ness A, Prossnitz ER, Sklar LA (2006). Glutathione-S-transferase-green fluorescent protein fusion protein reveals slow dissociation from high site density beads and measures free GSH. Cytometry A., 69(5):326-34.

[8] Kimple ME, Brill AL, Pasker RL (2013). Overview of affinity tags for protein purification. Curr Protoc Protein Sci., 73: Unit 9.9. doi: 10.1002/0471140864.ps0909s73.

[9] GE Healthcare (2016). Affinity Chromatography Handbook, Vol. 2: Tagged Proteins.

[10] Thermo Fisher Scientific (2015). Protein Expression Handbook

[11] Dynamic Biosensors (2018) Application Note: High-affinity capturing of tagged proteins on the switchSENSE? biochip using Strep-Tactin?XT.

[12] IBA Lifesciences (2016) Application Note: Strep-Tactin?XT:Twin-Strep-tag?- Advantages compared to the His-tag purification system.

[13] Bornhorst JA, Falke JJ (2000). Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods Enzymol., 326:245-54.

IBA lifesciences（德國(guó)）：IBA公司總部位于德國(guó)。二十年來(lái)，IBA以杰出的專(zhuān)利技術(shù)Strep-tag?系統(tǒng)為基礎(chǔ)，發(fā)展出完整的產(chǎn)品組合，涵蓋重組蛋白表達(dá)純化與固定以及特定細(xì)胞從全血或相關(guān)體液中分離的技術(shù)。同時(shí)，IBA也是全球領(lǐng)先的核酸合成專(zhuān)家，在DNA及RNA寡核苷酸的合成上已有超過(guò)二十年的經(jīng)驗(yàn)，能根據(jù)客戶(hù)的選擇，生產(chǎn)含有特定染料或化學(xué)修飾的特殊寡核苷酸。