技術(shù)天地

當(dāng)前位置： 首頁(yè) > 技術(shù)天地 > 技術(shù)專欄 > 醫(yī)學(xué) > 正文

一種快速高通量檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子活性的新方法--告別實(shí)驗(yàn)室苦力

作者：admin 信息來(lái)源：達(dá)科為日期：2021年08月27日打印字體：大中小

分享到：

轉(zhuǎn)錄因子通過與DNA結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而控制細(xì)胞分裂、代謝、凋亡和DNA修復(fù)等重要過程。因?yàn)樗鼈兛梢钥刂聘淖兗?xì)胞內(nèi)基因表達(dá)，所以轉(zhuǎn)錄因子是研究人員非常感興趣的。研究蛋白質(zhì)-DNA相互作用的科學(xué)家經(jīng)常依賴于WB或電泳遷移實(shí)驗(yàn)(EMSAs)，這種方法基于蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物和非復(fù)合物DNA在非變性條件下電泳遷移的相對(duì)差異，這些實(shí)驗(yàn)方法步驟較多，耗時(shí)較長(zhǎng)，通常需要放射性標(biāo)記的探針?；诖?，Genie公司發(fā)布了一種基于96孔板比色法的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品，在該方法中，感興趣的TF首先與包被在板底的含有蛋白結(jié)合共識(shí)序列的寡核苷酸結(jié)合，孵育識(shí)別TF抗體后，通過酶顯色方法來(lái)確定轉(zhuǎn)錄因子的活性。

比色法試劑盒與傳統(tǒng)的方法對(duì)比

從CHO-1細(xì)胞和經(jīng)過PMA（可以誘導(dǎo)AP-1 TF的活性）處理的CHO-1細(xì)胞中獲取核提取物，利用傳統(tǒng)的凝膠遷移方法和比色法同時(shí)檢測(cè)，凝膠位移分析顯示TF-DNA復(fù)合物的形成，通過放射性標(biāo)記的DNA遷移率的變化來(lái)證明，但確定經(jīng)處理和未處理的提取液之間的帶強(qiáng)度差異是有一定困難的（圖a）。相比之下，用比色法試劑盒檢測(cè)結(jié)果可發(fā)現(xiàn)不同處理組之間的差異非常清晰（圖b）。

比色法試劑盒的應(yīng)用

通過加入刺激劑或抑制劑來(lái)評(píng)價(jià)TF結(jié)合能力的差異是比色法試劑盒的一個(gè)特征。這個(gè)特點(diǎn)可以用于藥物快速高通量的篩選。不同濃度的TNF-α激活NF-κB p65，分別用200 ng/ml TNFα和50 ng/ml TNFα處理HeLa細(xì)胞30分鐘和120分鐘后，制備核提取物，然后評(píng)估NF-κB TF與其共識(shí)序列結(jié)合的相對(duì)變化。在低濃度時(shí)，TNFα使NF-κB活性增加了27倍以上，而在高濃度時(shí)，TNFα使NF-κB活性增加了50倍以上(圖a所示)。

同樣，通過測(cè)量了COS-7細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子-1α (HIF-1α)的激活。HIF-1α TF與腫瘤進(jìn)展有關(guān)，通過泛素化途徑抑制進(jìn)展的治療使其穩(wěn)定。2,2-dipyridyl是一種鐵螯合劑，可防止HIF-1α泛素化。用2,2-dipyridyl處理COS-7細(xì)胞17 h后，制備核提取物，然后測(cè)定HIF-1α TF與其一致序列的結(jié)合。與未處理的細(xì)胞相比，2,2-dipyridyl處理17 h后COS-7細(xì)胞的HIF-1α TF結(jié)合DNA的能力增加了3倍以上（圖b）。

Genie Transcription Factor Activity Kit（比色法）特點(diǎn)

01、選擇靈活性：細(xì)胞＆核裂解物，磷酸化轉(zhuǎn)錄因子或者WT轉(zhuǎn)錄因子

02、操作簡(jiǎn)單：整個(gè)孵育過程只需5h左右

03、快速篩選：轉(zhuǎn)錄因子抑制劑或激活劑的高通量篩選

04、特異性高：高度驗(yàn)證的抗檢測(cè)有活性的TF，排除與相近TF家族成員發(fā)生交叉反應(yīng)

05、指標(biāo)豐富：可提供數(shù)以百計(jì)的指標(biāo)。

Genie廠家生產(chǎn)的Transcription Factor Activity Kit試劑盒提供了一種快速、高效及高靈敏度的檢測(cè)方法來(lái)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合與其相對(duì)應(yīng)的DNA的能力。該系列試劑盒通過了多種類型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠，使用簡(jiǎn)單快捷，可有效地將研究人員從繁重的實(shí)驗(yàn)室勞動(dòng)中解放出來(lái)。